فصل دوم

2-1 کلیات 7

2-1-1                       اهمیت گیاهان دارویی 7

2-1-2                             متابولیت‌های ثانویه گیاهی 7

2-1-3    اهمیت پزشکی و دارویی متابولیت‌های ثانویه 9

2-2 زیست فناوری و تولید متابولیت‌های ثانویه گیاهی 9

2-2-1                                                کشت بافت و تولید متابولیت‌های ثانویه 9

2-2-2          کشت سلولی 10

2-2-3                                  کشت ریشه‌های موئین 11

2-2-4                مهندسی متابولیک 12

2-2-5                زیست فناوری و Arhizogenes 14

2-3   آگروباکتری رایزوژنز 15

2-3-1                                                                       مکانیسم برهم کنش آگروباکتری و سلول گیاهی 16

2-3-2               طبقه بندی ناقل‌های Ri 17

2-3-3               ژن‌های T-DNA ناقل Ri 18

2-3-4                                                                                                                                            ژن‌های Rol 19

2-3-5               باززایی گیاه كامل از ریشه‌های موئین 19

2-4      خصوصیات گیاه‌شناسی گیاه شقایق 20

2-4-1                                                     مسیرهای بیوسنتز آلکالوئیدهای گیاه شقایق 20

2-4-2                                     آلکالوئیدهای گیاه شقایق 22

2-5      سابقه پژوهش 24

فصل سوم

3-1 همسانه‌سازی 30

3-1-1          مواد گیاهی 30

3-1-2               سویه‌های باکتری 30

3-1-3                                                                                                                                             آغازگرها 30

3-1-4                          میزبان‌های همسانه‌سازی 31

3-1-5                                             محیط کشت باکتری و آنتی بیوتیک‌ها 34

3-1-6                   آنزیم‌های محدودگر 34

3-2 روش‌ها 35

3-2-1                                      شناسایی، جداسازی و تکثیر ژن 4′OMT 35

3-2-2                          همسانه‌سازی توالی ژنومی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T 37

3-2-3                                                                              ساخت cDNAی جهت تکثیر ژن 4′OMT 40

3-2-4                   تکثیر cDNAی ژن 4′OMT و همسانه‌سازی در ناقل pTZ57R/T 41

3-2-5                                           همسانه‌سازی سازه‌ی فوق بیانی ژن 4′OMT در ناقل pGSA1285 44

3-2-6                                                       تأیید مجدد سازه‌ی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM 46

3-3   کشت بافت و انتقال ژن 48

3-3-1                                                              بهینه‌سازی شرایط القای ریشه‌های موئین 48

3-3-2                                                                                                                                                کشت بذر 49

3-3-3                                                                                                 محیط‌های تلقیح و هم کشتی 50

3-3-4                         تلقیح و دوره هم کشتی 50

3-3-5                                           انتقال ریزنمونه‌ها به محیط گزینشگر 50

3-3-6                         استخراج DNA از ریشه‌های موئین و طبیعی گیاه شقایق 51

3-3-7                                                                                                                                          واکنش PCR 51

3-4 انتقال سازه‌ی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM به آگروباکتری رایزوژنز 52

3-4-1                                انتقال سازه‌ی فوق بیانی ژن 4′OMT به آگروباکتری رایزوژنز 53

3-4-2                                                          انتقال سازه‌ی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM به ریشه‌های موئین 53

3-4-3                              انتقال سازه‌ی فوق بیان ژن 4′OMT به ریشه‌های موئین گیاه شقایق 53

3-4-4                                                               آنالیز تراریزش ریشه‌های موئین با سازه خاموشی diox 54

3-4-5                                                                                                                  PCR در زمان واقعی 54

فصل چهارم

4-1 نتایج همسانه‌سازی 57

4-1-1                        تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT و تأیید آن با هضم آنزیمی 57

4-1-2          تأیید همسانه‌سازی توالی ژنومی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T 58

4-1-3                                                         نتایج بررسی بیوانفورماتیکی توالی ژنومی ژن 4′OMT 60

4-1-4                              تأیید همسانه‌سازی cDNA ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T 64

4-1-5                        تأیید همسانه‌سازی ژن 4′OMT در ناقل pGSA1285 66

4-1-6                                 تأیید مجدد سازه‌ی خاموشی diox با هضم آنزیمی 68

4-2   نتایج کشت بافت و انتقال ژن 69

4-2-1          نتایج بهینه‌سازی القای ریشه موئین 69

4-2-2                          درصد القای ریشه موئین 71

4-2-3                 تعداد شاخه فرعی ریشه موئین در یک سانتی‌متر 77

4-2-4                                   تعداد ریشه موئین در ریزنمونه 78

4-2-5                                                           روند تولید ریشه موئین برای سویه‌های مختلف 79

4-2-6                                            بررسی تراریختی ریشه‌های موئین با PCR 81

4-2-7                                 تأیید انتقال سازه‌ی خاموشی diox به آگروباکتری رایزوژنز 82

4-2-8                                                                            نتایج تایید تراریزش سازه خاموشی در ریشه‌های موئین با PCR 84

4-2-9          نتایج آنالیز PCRدر زمان واقعی 85

4-3   پیشنهادات 90

منابع       91

پیوست‌ها                                        100

فهرست اشکال                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                      شماره صفحه

شکل ‏2‑1: مکانیسم مولکولی خاموشی پس از رونویسی (Borgio, 2009)… 14

شکل ‏2‑2: شکل شماتیک نقشه ژنی ناقل Ri نوع مانوپین A. rhizogenes (Ozyigit et al., 2013).   17

شکل ‏2‑3: شکل شماتیک نقشه ژنی ناقل Ri نوع آگروپین A. rhizogenes (Ozyigit et al., 2013).   18

شکل ‏2‑4: مسیر سنتز آلکالوئیدهای مختلف در گیاه شقایق (Beaudoin and Facchini, 2014).   22

شکل ‏3‑1: ساختار ناقل همسانه‌سازی pTZ57R/T… 32

شکل ‏3‑2: ناقل اختصاصی pGSA1285… 33

شکل ‏3‑3 : دیاگرام سازه‌ی فوق بیانی ژن 4′OMT… 44

شکل ‏3‑4: مشابهت توالی دو ژن T6ODM و CODM و قطعه خاموشی. ناحیه مشترک دو ژن به رنگ طوسی و ناحیه قرمز رنگ مربوط به ناحیه ترجمه نشدنی انتهای ′3 ژن‌ها است. ناحیه سیز رنگ با نام DIOX-a نشان دهنده قطعه خاموشی است… 46

شکل ‏3‑5 : دیاگرام سازه خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM در ناقل pGSA1285.   47

شکل ‏4‑1: گرادیان دمایی جهت تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT در گیاه شقایق. چاهکkb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- : کنترل منفی، چاهک‌های 1 تا 7 به ترتیب دماهای اتصال: 2/47، 6/47، 7/49، 51، 8/53، 1/56 و 4/57 درجه سانتی‌گراد… 57

شکل ‏4‑2: هضم محصول PCR ژن 4′OMT با آنزیم HindIII. Kb1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک 1: قطعات برش خورده ژن 4′OMT، چاهک 2: محصول PCR برش نخورده ژن 4′OMT… 58

شکل ‏4‑3 : تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT با آنزیم پلیمرازی Pfu، چاهک 1Kb : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- :کنترل منفی، چاهک‌های 4-1: نمونه‌های تکثیری… 59

شکل ‏4‑4 : کلنی PCR برای تأیید حضور توالی ژنومی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T. چاهک Kb 1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی، چاهک C+: کنترل مثبت، چاهک‌های 1-22: کلنی‌های انتخابی… 59

شکل ‏4‑5 : هضم آنزیمی ناقل pTZ57R/T حاوی قطعه ژنومی ژن 4′OMT با آنزیم‌های NcoI و PmlI. چاهک 1: ناقل T/A برش نخورده حاوی قطعه ژنومی ژن 4′OMT، چاهک‌های 2-5: ناقل T/A برش خورده حاوی قطعه ژنومی ژن 4′OMT و خروج قطعه ژنومی ژن 4′OMT… 60

شکل ‏4‑6 : نتیجه توالی‌یابی، توالی ژنومی ژن 4′OMT، رنگ سبز نشان دهنده توالی اینترون ژن 4′OMT و به طول bp 114 است… 61

شکل ‏4‑7 : همردیفی توالی ژنومی جداسازی شده 4’OMT با توالی موجود در Genbank در بردارنده توالی اینترون. در این شکل توالی اینترونی در ناحیه 844 تا bp 859 قرار دارد.   62

شکل ‏4‑8 : دومین‌های عملکردی موجود در ساختار پروتئین 4’OMT.. 63

شکل ‏4‑9 : توالی اسیدآمینه مربوط به دومین‌های عملکردی موجود در ساختار ژن 4’OMT.   63

شکل ‏4‑10 : همردیفی توالی پروتئین 4′OMT موجود در Genbank با توالی همسانه‌سازی شده.   64

شکل ‏4‑11 : تکثیر توالی cDNA ژن 4′OMT با آنزیم پلیمرازی Pfu، چاهک 1Kb : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- : کنترل منفی، چاهک C+ : کنترل مثبت (توالی ژنومی ژن 4′OMT)، چاهک 1-4: محصول PCR حاصل از تکثیر ژن 4′OMT به طول bp 1074… 64

شکل ‏4‑12: کلنی PCR برای تأیید حضور توالی cDNAی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T. چاهک 1-21: کلنی‌های مورد بررسی، چاهک C- : کنترل منفی، C+: کنترل مثبت (DNA ژنومی) چاهک Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی… 65

شکل ‏4‑13: هضم آنزیمی ناقل pTZ57R/T حاوی cDNAی ژن 4′OMT با آنزیم‌های XhoI و SpeI. چاهک Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهک 1 : مربوط به ناقل T/A برش نخورده حاوی cDNAی ژن 4′OMT، چاهک 2 تا 6: ناقل T/A برش خورده و خارج شدن ژن 4′OMT… 65

شکل ‏4‑14: نتیجه توالی‌یابی همسانه‌سازی توالی cDNA ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T.   66

شکل ‏4‑15: کلنی PCR برای تأیید حضور ژن 4′OMT در ناقل pGSA1285. چاهک Kb 1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی، چاهک C+: کنترل مثبت (ناقل T/A حاوی ژن 4′OMT)، چاهک‌های 1-7: کلنی‌های انتخابی… 67

شکل ‏4‑16: هضم آنزیمی ناقل pGSA1285 حاوی cDNAی ژن 4′OMT با آنزیم‌های XhoI و SpeI. چاهک Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهک 1 : ناقل pGSA1285 برش نخورده حاوی cDNAی ژن 4′OMT، چاهک 2 و 3: ناقل pGSA1285 برش خورده و خارج شدن ژن 4′OMT… 68

شکل ‏4‑17: هضم آنزیمی ناقل pGSA1285 جهت تأیید سازه‌ی خاموشی diox با آنزیم‌های AscI و SpeI. چاهک 1Kb: نشانگر وزن مولکولی، چاهک 1: برش ناقل pGSA1285 و خارج شدن سازه خاموشی diox، چاهک 2: ناقل برش نخورده pGSA1285 حاوی سازه‌ی خاموشی diox… 69

شکل ‏4‑18: توسعه ریشه موئین در گیاه شقایق بعد از تلقیح با Agrobacterium rhizogenes . A، B و C ریزنمونه اندام هوایی، به ترتیب 8، 16 و 24 روز بعد از تلقیح، D : ریزنمونه هیپوکوتیل، 12 روز بعد از تلقیح… 71

شکل ‏4‑19: اثر دما، سویه و محیط کشت بر درصد القای ریشه موئین برای ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند… 72

شکل ‏4‑20: اثر دما، سویه و محیط کشت بر درصد القای ریشه موئین برای ریزنمونه‌ هیپوکوتیل در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند… 75

شکل ‏4‑21: اثر دما، سویه و محیط کشت بر تعداد شاخه فرعی ریشه موئین در یک سانتی‌متر برای ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند… 78

شکل ‏4‑22: اثر دما، سویه و محیط کشت بر تعداد ریشه موئین در ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند… 79

شکل ‏4‑23: روند تولید ریشه‌های موئین (در ریزنمونه اندام هوایی) برای سویه‌های آگروباکتری رایزوژنز در روزهای 8، 12، 16، 20 و 24 (DAI). در محیط MS و دمای 17 و 25 درجه سانتی‌گراد به ترتیب (الف و ب)، در محیط ½ MS و دمای 17 و 25 درجه سانتی‌گراد به ترتیب (ج و د)… 80

شکل ‏4‑24 : نتایج آنالیز PCR جهت تأیید تراریختی ریشه‌های موئین با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی ژن rolB در گیاه شقایق. چاهک100 bp : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی (ریشه‌های معمولی)، چاهک C+: کنترل مثبت (ناقل Ri از A. rhizogenes)، چاهک‌های 1 تا10: ریشه‌های موئین تراریخته… 81

شکل ‏4‑25: نتایج آنالیز PCR جهت تأیید تراریختی ریشه‌های موئین با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی ژن rolC در گیاه شقایق. چاهک bp100: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- : کنترل منفی (ریشه‌های معمولی)، چاهک C+ : کنترل مثبت (ناقل Ri از A. rhizogenes)، چاهک‌های 1 تا10: ریشه‌های موئین تراریخته… 82

شکل ‏4‑26: کلنی-PCR برای تأیید حضور سازه‌ی خاموشی diox در آگروباکتری رایزوژنز سویه ATCC15834. چاهک 100 bp: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی، چاهک C+: کنترل مثبت (ناقل pGSA1285 حاوی سازه خاموشی diox)، چاهک‌های 1 تا 6: کلنی-PCR‌های آگروباکتری رایزوژنز… 83

شکل ‏4‑27 : تأیید انتقال سازه‌ی خاموشی diox به آگروباکتری رایزوژنز سویه ATCC 15834 با PCR. bp 100 : نشانگر وزن مولکولی، 1C- : کنترل منفی (آب)، 2C- : کنترل منفی (باکتری E.coli بدون سازه)، 1C+ : کنترل مثبت (ناقل pGSA1285 حاوی سازه خاموشی diox)، 2C+ : کنترل مثبت (باکتری E.coli حاوی سازه خاموشی diox)، 1 و 2: نمونه‌های تکثیری با آغازگرهای pGSA-F و nptII-R1… 83

شکل ‏4‑28: ظهور ریشه‌‌های موئین روی ریزنمونه‌ی اندام هوایی در گیاه شقایق، سه هفته پس از تلقیح با آگروباکتری رایزوژنز سویه‌ی ATCC15834 حاوی سازه خاموشی مشترک Diox.   84

شکل ‏4‑29: قسمت الف، ب و ج) به ترتیب تکثیر اختصاصی ژن‌های rolB، rolC و virG در کلون‌های ریشه موئین. چاهک bp 100: نشانگر وزن مولکولی، چاهک -C : کنترل منفی، چاهک C+ : کنترل مثبت (ناقل ATCC15834)، چاهک 1-20: کلون‌های ریشه موئین. د) چاهک Kb 1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک -C : کنترل منفی، چاهک 1-20: کلون‌های ریشه موئین جهت بررسی وجود سازه خاموشی diox… 85

شکل ‏4‑30 : منحنی جذب فلورسنت نمونه‌های مورد آنالیز، خط افقی قرمز رنگ، نشان دهنده حدآستانه (Threshold) می‌باشد که محل تقاطع آن با هر کدام از منحنی‌ها شاخص CT تعیین شد.   86

شکل ‏4‑31 : نمایش منحنی ذوب نمونه‌های مورد آنالیز مربوط به ژن T6ODM (پیک‌های سمت چپ) و ELF1 (پیک‌های سمت راست)، پیک‌های که در دمای پائین‌تر هستند نشان دهنده قطعات کوچکتر هستند… 87

شکل ‏4‑32: میزان بیان ژن T6ODM در کلون‌های ریشه موئین تراریخته با سازه خاموشی مشترک Diox (2) در مقایسه با ریشه های موئین شاهد (1)… 88

شکل ‏4‑33: میزان بیان ژن CODM در کلون‌های ریشه موئین تراریخته با سازه خاموشی مشترک Diox (2) در مقایسه با ریشه های موئین شاهد (1)… 88

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                          شماره صفحه

جدول ‏3‑1: آغازگرهای رفت و برگشتی مورد استفاده.. 31

جدول ‏3‑2 : آنتی بیوتیک‌ها و غلظت‌های مورد استفاده.. 34

جدول ‏3‑3: آنزیم‌های برشی محدودگر مورد استفاده.. 34

جدول ‏3‑4: محتویات واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT.. 36

جدول ‏3‑5: سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT   36

جدول ‏3‑6 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با آنزیم HindIII. 37

جدول ‏3‑7: محتویات واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT با بهره گرفتن از آنزیم pfu... 38

جدول ‏3‑8: سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT با بهره گرفتن از آنزیم pfu. 38

جدول ‏3‑9 : اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق توالی ژنومی ژن 4′OMT به داخل ناقل pTZ57R/T.. 39

جدول ‏3‑10 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم NcoI و PmlI. مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد… 40

جدول ‏3‑11: اجزای ترکیب ساخت cDNA جهت تکثیر ژن 4′OMT… 41

جدول ‏3‑12 : محتویات واکنش PCR برای تکثیر cDNAی ژن 4′OMT با بهره گرفتن از آنزیم pfu.   42

جدول ‏3‑13 : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر cDNAی ژن 4′OMT با بهره گرفتن از آنزیم pfu. 42

جدول ‏3‑14 : اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق cDNAی ژن 4′OMT به داخل ناقل pTZ57R/T   43

جدول ‏3‑15 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم XhoI و SpeI. مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد… 43

جدول ‏3‑16 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم XhoIو SpeI مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد… 45

جدول ‏3‑17: اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق توالی ژن 4′OMT به داخل ناقل pGSA1285.   45

جدول ‏3‑18 : محتویات واکنش PCR برای تأیید سازه‌ی خاموشی Diox… 47

جدول ‏3‑19: سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تأیید سازه‌ی خاموشی Diox.   48

جدول ‏3‑20 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم AscI و SpeI. مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد… 48

جدول ‏3‑21 : محتویات واکنش PCR برای تکثیر ژن‌های rolB و rolC… 52

جدول ‏3‑22 : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر ژن‌های rolB و rolC.   52

جدول ‏3‑23: اجزای واکنش Real-time PCR برای بررسی بیان ژن‌های T6ODM و CODM.   54

خرید فایل متن کامل در سایت zusa.ir

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *