2- مروری بر پژوهش­های پیشین. 5

2-1- بیماری­های گیاهی و مهند سی ژنتیک  5

2-2- توتون “سیستم بیان گیاهی متداول”  6

2-3- معرفی پپتیدهای ضد میکروبی  6

2-3-1- پپتیدهای ضدمیکروبی با منشا حشرات. 7

2-3-2- پپتیدهای ضدمیکروبی شناسایی شده در دیگر حیوانات. 7

2-3-3 – پپتیدهای ضدمیکروبی حاصل از سنتز مصنوعی. 7

2-3-4- پپتیدهای ضدمیکروبی حاصل از میکروارگانیسم­های مهندسی شده. 8

2-3-4-1- باکتری­ ها. 8

2-3-4-2- مخمرها. 9

2-3-4-3- گیاهان. 9

2-4- 1- معرفی لاکتوفرین. 11

2-4-2- بررسی ساختار ژنی لاکتوفرین. 11

2-4-3- ویژگی پروتئین لاکتوفرین. 11

2-4-4- نقش پروتئین لاکتوفرین. 12

2-4-5- فعالیت ضد قارچی و ضد باکتریایی پروتئین لاکتوفرین. 12

2-4-6- فعالیت ضد ویروسی پروتئین لاکتوفرین. 13

2-4-7- فعالیت ضد سرطانی پروتئین لاکتوفرین. 13

2-5- ویروس موزاییک خیار(Cucumber mosaic virus)   14

2-6- پژمردگی جنوبی باکتریایی گیاهان تیره سولاناسه  14

3- مواد و روش­ها. 16

3-1- مواد گیاهی  16

3-2- مایع زنی ویروس موزاییک خیار به توتون رقم زانتا  16

3-3- واکنش گیاهان تراریخت و تیپ وحشی به ویروس موزاییک خیار  17

3-4- آزمون الایزا برای ویروس موزاییک خیار  17

3-5- تایید تراریختی  18

3-5-1- استخراج DNA ی ژنومی. 18

3-5-2- انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز با بهره گرفتن ازDNA ژنومی  20

3-6- تهیه ی ژل آگارز و انجام الکتروفورز. 22

3-7- استخراج RNA  23

3-8- تیمار DNase 25

3-9- سنتز رشته اول cDNA  26

3-10- انجام Real-Time PCR جهت مقایسه ی میزان بیان ژن لاکتوفرین در گیاهان تراریخت  27

3-11- انجام Real-Time PCR جهت مقایسه­ ژن cp ویروس موزاییک خیار در گیاهان تراریخت و تیپ وحشی. 29

3-12- باکتری پژمردگی آوندی R. solonacerum. 30

3-12-1- مواد گیاهی. 30

3-12-2-کشت باکتری R. solanacearum و مایه زنی آن به گیاهان تراریخته. 31

4- نتیجه گیری. 33

4-1- مشاهده­ علایم. 33

4-1-1- توتون­های تیپ وحشی. 33

4-1-2- ظهور علایم درتوتون­های تراریخت. 34

4-2- آزمون الایزا. 36

4-2-1- آزمون الایزا زمان صفر(زمان ظهور علایم در تیپ وحشی)  37

4-2-2- آزمون الایزا زمان20روز بعد از مایه زنی ویروس موزاییک خیار. 37

4-3- استخراج DNAگیاهان تراریخت  39

4-3-1- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای تایید وجود ژن لاکتوفرین در گیاهان تراریخت. 39

4-4- استخراج RNAو ساخت cDNA  40

4-5- انجام Real Time PCR. 42

4-5-1- انجام Real Time PCR برای ژن لاکتوفرین. 42

4-5-2- انجام Real Time PCR برای ژن cp ویروس موزاییک خیار  43

4-6- مایه زنی باکتری R. solonaserum به توتون. 46

6- بحث. 47

7- منابع. 49

 

 

 

 

 

فهرست جدول‌ها

عنوان…………………………………… …………. صفحه

جدول 3-1- محول ضدعفونی کننده بذر توتون.. 16

جدول 3-2- تهیه ی بافر استخراج DNA.. 19

جدول 3-3- پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر و تایید ژن لاکتوفرین   20

جدول 3-4- سیکل گرمایی استفاده شده در هر واکنشPCR 21

جدول 3-5- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR.. 22

جدول 3-6- نوع و میزان مواد به کار رفته برای تیمار DNase. 25

جدول 3-7- مواد مورد استفاده در مرحله اول سنتز cDNA.. 26

جدول 3-8- مواد مورد استفاده در مرحله دوم سنتز cDNA.. 27

جدول 3-9- آغازگرهای به کار رفته ژن لاکتوفرین برای Real-Time PCR و ژن کنترل داخلی.. 27

جدول 3-10- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی…….. 28

جدول 3-11- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن کنترل داخلی.. 29

جدول 3-12- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژنcp ویروس موزاییک خیار و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی.. 30

جدول 3-13- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن cp ویروس موزاییک خیار و ژن کنترل داخلی.. 30

جدول 4-1- تاخیر ظهور علایم پس از 15 روز از مایه زنی ویروس موزاییک خیار در گیاهان تراریخت.. 36

 

 

فهرست شکل ها

عنوان……………………………………………………………………………………………………………………………… صفحه

 

شکل 4-1- ظهور علایم در توتون های تیپ وحشی.. 33

شکل 4-2- گیاهان تراریخت هنگام ظهور علایم در تیپ وحشی‌ها.. 34

شکل 4-3- گیاهان تیپ وحشی بعد از 30 روز مایه زنی ویروس موزاییک خیار.. 34

شکل 4-4- گیاهان تراریخت پس از 15 روز از ظهور علایم در تیپ وحشی­ها   35

شکل 4-5- آزمون الایزا در زمان صفر.. 37

شکل 4-6- رشد ویروس در تراریخت ها و تیپ وحشی در 20 روز بعد ازمایه زنی ویروس موزاییک خیار.. 38

شکل 4-7- آزمون الایزا در زمان 30 روز بعد مایه زنی ویروس موزاییک خیار.. 39

شکل 4-8- نقوش الکتوفروزی محصول PCR با پرایمرهای partial ژن لاکتوفرین.. 40

شکل 4-9- استخراج RNA از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی.. 40

شکل 4-10- نقوش الکتروفورز PCR آغازگرهای Real-Time با آغازگرهای ژن لاکتوفرین:.. 41

شکل 4-11- تیمار DNase توتون تیپ وحشی پس از 22 روز از مایه زنی باکتری.. 41

شکل 4-12- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن لاکتوفرین در لاین­های تراریخت.. 42

شکل 4-13- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن cp ویروس موزاییک خیار   43

شکل 4-14- کشت عصاره ی حاصل از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی.. 44

شکل 4-15- پژمرده گی گوجه پس از 26 روز از مایه زنی باکتری   45

شکل 4-16- توتون تراریخت 22 روز بعد از مایه زنی باکتری R. solonaserum.. 45

شکل 4-17- توتون تیپ وحشی 22 روز بعد از مایه زنی باکتری R. solonaserum.. 45

 

 

 

 

فصل اول

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1-­ مقدمه

 

براساس یک تخمین محافظه کارانه، بیماری­ها، حشرات و علف های هرز در سطح جهانی سالانه بین 31 تا 42% محصولات کشاورزی را نابود کرده و یا از تولید آن­ها جلوگیری می­ کنند. میزان خسارت به طور معمول در کشورهای پیشرفته و در کشورهای در حال پیشرفت که نیاز غذایی بیشتری دارند، بالاتر است (Tisdell and Xiang, 1998). اگر متوسط میزان خسارت را 5/36% بگیریم، سهم بیماری ها، حشرات و علف های هرز دراین خسارت به ترتیب 1/14%، 2/10% و 2/12% شده است. با توجه به اینکه بیماری ها به تنهایی موجب نابودی 1/14% محصولات می شوند، مقدار خسارت سالانه آن­ها در سطح جهانی بالغ بر220 میلیارد دلار می شود (Wood and Derek, 2001).

طی یک صد سال گذشته، کنترل بیماری­ها و سایر آفات گیاهی به طور فزاینده­ای به استعمال مواد شیمیایی سمی وابسته است. کنترل بیماری­های گیاهی اغلب کاربرد این مواد سمی را نه تنها بر روی گیاه و محصولات گیاهی مورد استفاده­ی ما، بلکه درون خاک جایی که بسیاری از میکروارگانیزم­های بیماری­زا زندگی کرده و به ریشه­ گیاه حمله می­ کنند، ضروری ساخته است. بسیاری از این مواد شیمیایی برای میکروارگانیزم­های غیر هدف، حیوانات و حتی برای انسان نیز ممکن است سمی باشند. دشوار است که بتوان هزینه­ های بلند مدت و کوتاه مدت آلودگی محیط زیست بر سلامتی و به­زیستی انسان را که براثر تلاش ما برای کنترل بیماری های گیاهی و سایر آفات به وجود می آید، تخمین زد. شمار زیادی از بیمارگرهای گیاهی از ویروئیدهای دارای چند صد نوکلئوتیدی تا گیاهان عالی در محصولات کشاورزی ایجاد بیماری می­ کنند. دامنه­ی اثرات این بیماری زا از اثرات خفیف تا نابودی کامل محصول است. گروه­های عمده بیمارگرها شامل ویروس­ها، باکتری­ ها، قارچ­ها، اوومیست­ها، ویروس­ها و نماتدها می­باشند. کنترل عوامل بیماری­زای گیاهی مشکل است زیرا جمعیت آنها بسته به زمان، مکان و نوع ژنوتیپ متغیر است. بنابراین برای مبارزه با تلفاتی که آن­ها به وجود می ­آورند، لازم است به تعریف مشکل پرداخت و به دنبال راه­حل­هایی بود. در سطح زیستی نیاز به روش­هایی برای تشخیص دقیق و سریع اورگانیزم ایجاد کننده­ی، بیماری تخمین دقیق شدت بیماری، اثر بیماری روی محصول و تشخیص مکانیسم ­های بیماری­زایی می­باشد. در مرحله­ی بعد خسارت بیماری باید به وسیله­ی کاهش مایه تلقیح بیمارگر، کاهش مکانیسم های بیماری­زایی آن و افزایش گوناگونی ژنتیکی در محصول به حداقل برسد (Reed et al., 2003). هدف بیشتر پژوهش­های جدید در بیماری­شناسی گیاهی یافتن شیوه ­های دیگر برای کنترل بیماری­های گیاهی است که به محیط زیست آسیب کمتری برسانند. روش­های انتقال در سال­های اخیر به عنوان یک موضوع مهم برای ایجاد مقاومت مورد بررسی قرار گرفته است. امید ­بخش­ترین این روش­ها عبارتند از:

  • تولید گیاهان مقاوم به بیماری از طریق مهندسی ژنتیک
  • تولید گیاهان مقاوم به بیماری از طریق به­نژادی گیاهی سنتی
  • کاربرد فنون زراعی برای سرکوب بیماری
  • کاربرد فنون خاموشی ژن
  • استفاده از مواد غیر سمی افزایش دهنده­ی مقاومت
  • بهره­وری از عوامل زیستی ناهمساز به میکرواورگانیزم­های مولد بیماری (ایزدپناه و همکاران، 1389 و Strange et al., 2005)

با توجه به ضرورت ارقام گیاهی مقاوم به تنش­های زیستی و غیر زیستی و نارسایی روش­های سنتی به­نژادی گیاهی، به کارگیری روش­های موثر تنها راه برون رفت از این مشکل می­باشد. در سال­های اخیر، با پیشرفت بدست آمده از در زیست شناسی مولکولی و روش­های کشت بافتی گیاهی روش­های جدیدتر و کارآمدتری را در مهندسی ژنتیک، برای چیره­گی بر محدودیت­های به­نژادی گیاهی سنتی فراهم کرده است. بنابراین استفاده از مهندسی ژنتیک برای دستیابی به ارقام مفید می باشد. با بهره گرفتن از فنون انتقال ژن، گیاهان تراریخت با یک ویژگی مشخص می توانند یک ژن از منبع ژنی متفاوت دریافت نمایند به نحوی که سایر ویژگی­های مطلوب گیاه تحت تاثیر قرار نگیرد. بنابراین ­کاربرد سموم شیمیایی هنوز موثرترین روش برای کنترل بیماری­های گیاهی هستند، اما کاربرد بیش از اندازه­ باکتری­کش‌ها و قارچ­کش­ها­ی شیمیایی منجر به شدید شدن و طولانی شدن دوره­ های آلودگی محیط زیست و مقاوم شدن بیمارگرها نسبت به این سموم شده است (Daoubi et al., 2005). اگرچه روش­های اصلاحی یکی از موثرترین راهکارها در تولید گیاهان مقاوم به بیماری­ها بوده اما این روش دارای محدودیت­هایی مانند فقدان پل ژنی دهنده­ی مناسب و شکستن مقاومت می­باشد. از سوی دیگر روش­های بیوتکنولوژی به طور موفقیت­آمیزی در تولید محصولات گیاهی مقاوم علیه بیمارگرها و آفات موثر بوده است، در این روش­ها ژن بیان کننده­ پپتید­های ضدمیکروبی را در گیاهان بیان کرده و باعث مقاومت گیاه به بیماری مورد نظر شده است (Tingquan et al., 2013).

1-1- ­ پپتیدهای ضد میکروبی

پپتیدهای ضد میکروبی یکی از اجزای سیستم ذاتی ایمنی محسوب می­ شود که معمولا به عنوان اولین خط دفاعی علیه پاتوژن­ها عمل می­ کنند. چند ویژگی که معمولا در همه­ی پپتید­های ضد عمومیت دارد شامل: توالی کوتاه بین 30 تا60 اسید آمینه آمینه، خاصیت کاتیونی قوی، قابلیت تحمل دما تا 100 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه می­باشد. پپتیدهای ضد میکروبی بوسیله­ی موجودات مختلف تولید می­شوند که شامل باکتری­ ها حشرات، گیاهان و مهره داران می باشد (Boulanger et al., 2006). پپتید­های ضد میکروبی طیف وسیعی از میکروارگانیسم­ها شامل باکتری­ های گرم مثبت و گرم منفی، قارچ­ها، میکروپلاسماها و ویروس­ها را کنترل می­ کنند. بیش از 1500 پپتید ضد میکروبی در جانوران، گیاهان و میکروارگانیسم­ها شناسایی شده است (Parachin et al., 2012 ; Li et al., 2012).

بیان ژن­های کد کننده­ پپتیدهای ضدمیکروبی با منشا گیاهی در گیاهان تراریخته باعث تغییر کمی در مقاومت گیاه علیه بیمارگرهای گیاهی می شود، زیرا بیمارگر با گیاه در یک مدت طولانی با هم تکامل یافته­اند اما بیان ژن های کد کننده­ یپپتیدهای ضدمیکروبی از منابع دیگر در گیاهان منجر به سطح بالایی از مقاومت در برابر طیف وسیعی از بیماری­ها شده است (Burrowes et al., 2005).

 

1-2- پروتئین لاکتوفرین

پروتئین لاکتوفرین یکی از اعضای خانواده­ی ترانسفرین ها می باشد که دارای خاصیت اتصال شونده­گی به آهن است. لاکتوفرین­ها اغلب آمفی­پاتیک حاوی بار مثبت و مناطق هیدروفیل هستند که به دومین مولکول­های حاوی بار منفی در سطح میکرواورگانیسم متصل می­شوند که این مکانیسم به لاکتوفرین اجازه می­دهد به راحتی با غشا باکتری که شامل مجموعه ­ای از مولکول­های آمفی­پاتیک می­باشد، واکنش دهد، مخصوصا با باکتری­ هایی که سطح غشا آن­ها دارای بار منفی می­باشند (Legrand and Mazurier, 2010 ).

 

1-3- هدف

در این پروژه بیمارگرهای باکتریایی و ویروسی به گیاهان ترایخت نسل دوم توتون حاوی ژن لاکتوفرین شتر عربی با هدف ایجاد مقاومت توتون­های تراریخت نسبت به این بیمارگرها مایه­زنی گردید.

 

 

 

 

 

 

فصل دوم

 

 

 

 

 

 

2- مروری بر پژوهش­های پیشین

 

2-1- بیماری­های گیاهی و مهند سی ژنتیک

با تشخیص القای تومور درگیاهان توسط Agrobacterium tumefaciens به­واسطه­ انتقال T-DNA موجود روی پلاسمید باکتری ایجاد می­ شود، کاربرد از آن برای ایجاد گیاهان تراریخت معمول شده است. اگر چه از تکنیک­های دیگری مانند الکتروپوراسیون[1] و بیولیستیک[2] نیز استفاده می­ شود. روش های سنتی به­نژادی گیاهان شامل تلاقی­های مختلف و روش­های درون شیشه ­ای مکمل این روش­ها در ایجاد گیاهان با صفات مطلوب می­باشند. در سال­های اخیر ظهور روش­های مهندسی ژنتیک به عنوان ابزاری جدید در تحقیقات کشاورزی همسو با به­نژادی سنتی در گسترش روش­های جدید برای دستورزی ژنتیکی گیاهان نقش بسیار مهمی ایفا کرده است. یکی از شاخه­های زیست فناوری گیاهی انتقال ژن­های خاص به سلول­های گیاهی و یا بازایی گیاه از این سلول‌ها با بهره گرفتن از روش­های کشت بافت گیاه می­باشد. بنابراین زیست فناوری این پتانسیل را دارد که با تولید گیاهان با خصوصیات بهبود یافته مکمل روش­ها­ی سنتی به نژادی گیاهان شود. بر خلاف روش­های به نژادی سنتی که در آّن دسته­ای از ژن­ها منتقل می­ شود (Wood and Derek, 2001). در روش­های مبتنی بر زیست فناوری می­توان یک ژن مشخص را از هر موجودی انتخاب و به جاندار دیگر انتقال داد. سوالی که در روش­ها­ی مهندسی ژنتیک مطرح می­ شود این است که چه ژن­های باید منتقل شوند که پاسخ به این سوال بستگی به نوع هدفی که در انتقال ژن دنبال می شود، دارد. در مبارزه با بیماری­ها با بهره گرفتن از مهندسی ژنتیک دسته اول ژن­های کاندیدا برای انتقال ژن­های هستند که ویژگی­های بیماری­زای بیمارگر به عنوان مثال آنزیم­ های تجزیه کننده توکسین­ها را باز داشته یا آن را از بین می­برند یا ژن­هایی که مقاومت گیاه را افزایش می­­دهند. دسته بعدی ژن­هایی هستند که غلظت پپتید­های ضد­میکروبی را افزایش می­ دهند (Strange et al., 2005).

خرید فایل متن کامل در سایت zusa.ir

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *