1-2-6 همولوژی……………………………………. 11

1-2-7 کشت سلول های خونی……………………………………. 11

1-2-7-1 تاریخچه…………………………………… 11

1-2-7-2 اصول بنیادی……………………………………. 12

1-2-8 تکنیک های باندینگ (رنگ آمیزی) كروموزوم ها……………… 12

1-2-8-1 تاریخچه…………………………………… 12

1-2-8-2 اصول پایه ای……………………………………. 13

1-2-9- هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH)………………… 15

1-2-9-1 تاریخچه…………………………………… 15

1-2-9-2 اصول بنیادی……………………………………. 15

1-2-9-3 استفاده از FISH در پژوهش های ستوژنتیک حیوانات اهلی………. 16

1-2-9-4 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیک FISH برای تایید صحت گردآوری های ژنوم موجودات…………….17

1-2-9-5 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیک FISH برای اتصال نقشه های لینكاژی و RH روی كروموزوم ها……..19

1-2-9-6 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیک FISH در رهیافت كلونینگ موقعیتی ژن ها و QTLها……………..20

1-2-10 انواع پروب های کلون DNA ژنومی استفاده شده در FISH……………….

1-2-11 ایمونوفلوروسنس…………………………………….. 21

1-2-12 ویژگی های متافاز ها و نقشه های سیتوژنتیک خانواده گاو سانان………….22

1-2-12-1 آتوزوم ها و نقشه های سیتوژنتیك…………………………… 22

1-2-12-2 كروموزوم های جنسی……………………………………. 26

1-2-13 بررسی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9………………..

1-2-13-1 ژن برولا (FecB) …………………………………..27

1-2-13-2 ژن GDF9 (FecGH)…………………………………..

1-2-13-3 ژن BMP15 (FecX)…………………………………..

1-2-13-4 اثر متقابل بین جهش های موثر بر باروری…………… 30

فصل دوم…………………………………… 32

بررسی منابع…………………………………… 32

2-1 سابقه مطالعات سیتوژنتیک و نقشه یابی ژن ها با تكنیک FISH در حیوانات مزرعه ای……..33

2-2 سابقه مطالعه ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در حیوانات مزرعه ای…………..37

فصل سوم…………………………………… 40

مواد و روش ها………………………………….. 40

3- مواد و روش ها………………………………….. 41

3 – 1  تهیه نمونه های خون و کشت سلول های خونی…………….. 41

3 – 1- 1 تهیه ی نمونه های خون…………………………………… 41

3 – 1- 2 کشت سلول های خونی با روش RB و انتخاب اسلاید های  مناسب برای FISH……….

3-2 انتخاب و سفارش كلون های BAC……………………………….

3-2-1 شناسایی كلون های BAC حاوی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9…………..

3-2-1-1 ژن BMPR1B…………………………………….

3-2-1-2 ژن BMP15……………………………………

3-2-1-3 ژن GDF9……………………………………

3-3 كشت باكتری های حاوی كلون های BAC و استخراج DNA………………..

3-4 نشاندارسازی DNA استخراج شده از كلون های BAC………………………

3-5 تهیه كاریوتایپ گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز………………. 51

3-6 هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH)……………………………. 51

3-7 مراحل بعد از FISH…………………………………….

3-7-1 آشكار سازی سیگنال های FITC…………………………………….

3-7-2 RBPI- باندینگ…………………………………….. 53

3-8 بررسی میكروسكوپی اسلایدها و ردیابی سیگنال های FITC…………….

3-9 تعیین محل دقیق (باند كروموزومی) ژن های مورد مطالعه روی كروموزوم ها……54

فصل چهارم…………………………………… 55

نتایج……………………………………. 55

4- نتایج……………………………………. 56

4-1 كیفیت DNA استخراج شده از كلون های BAC…………….

4-2 نتایج حاصل از كشت سلولی و كاریوتایپ های تهیه شده برای گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با روش RBA- باندینگ…….56

4-2-1 كاریوتایپ RBA- باندینگ گاو (BTA)………………………………….. 56

4-2-2 كاریوتایپ RBA- باندینگ گاو میش رودخانه ای (BBU)………… 56

4-2-3 كاریوتایپ RBA- باندینگ گوسفند (OAR)………………………… 56

4-2-4 كاریوتایپ RBA- باندینگ بز (CHI)………………………………….. 57

4-3 جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با بهره گرفتن از تكنیک FISH روی كروموزوم های RBPI- باندینگ گونه های مورد مطالعه…………………………………..57

4-3-1 جایگاه فیزیكی  ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو (BTA)………………..57

4-3-2 جایگاه فیزیكی  ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو میش رودخانه ای (BBU)……57

4-3-3 جایگاه فیزیكی  ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گوسفند (OAR)…………..57

4-3-4 جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در بز (CHI)…………………….58

4-4 مقایسه جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با انسان…………58

فصل پنجم…………………………………… 96

بحث و نتیجه گیری……………………………………. 96

5- بحث……………………………………. 97

5-1 نقشه های ژنتیکی……………………………………. 97

5-2 تفاوت های نقشه های فیزیكی و لینكاژی…………….. 98

5-3 ژنومیکس مقایسه ای……………………………………. 99

5-4 نتیجه گیری نهایی……………………………………. 103

5-5 پیشنهادات……………………………………. 103

واژه نامه…………………………………… 104

منابع و مآخذ…………………………………… 106

Abstract…………………………………..

چکیده:

هدف اصلی در پژوهش های ژنومی حیوانات اهلی تهیه نقشه های ژنومی جامعی است که بتواند شناسایی جایگاه های موثر بر صفات مهم اقتصادی را امکان پذیر سازد. انتظار می رود که شناسایی چنین جایگاه­هایی منجر به طراحی برنامه های کارآمد اصلاح نژادی، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتیجه افزایش صحت و پیشرفت انتخاب در حیوانات مزرعه­ای شود. هدف مطالعه حاضر مكان یابی فیزیكی مقایسه ای كلون های BAC گاوی حاوی ژن های باروری فاکتور رشد تمایز یافته 9 (GDF9)، پروتئین ریخت زای استخوان 15 (BMP15) و گیرنده نوع یک آن (BMPR1B) با بهره گرفتن از تكنیک هیبرید سازی در محل فلورسنتی (FISH) برای اولین بار روی كروموزوم های R- باندینگ گاو (BTA, 2n=60)، گاو میش رودخانه ای (BBU, 2n=50)، گوسفند (OAR, 2n=54) و بز (CHI, 2n=60) با توجه به استاندارد ISCNDB 2000 بوده است. برای تهیه كروموزوم های R- باند شده با وضوح زیاد، نمونه های خون كامل از گونه های مورد مطالعه با وارد سازی دیر هنگام BrdU و Hoechst33258 كشت شدند. كلون های BAC حاوی ژن های مورد نظر از روی آخرین سازه ژنوم گاوی با توجه به گردآوری های توالی ژنوم گاوی UMD_3.1 و Btau_4.6.1 شناسایی شده و سپس از كتابخانه BAC گاوی موسسه INRA تهیه شدند. پس از کشت کلون ها، استخراج DNA و نشاندار سازی آن با روش Nick translation، اسلایدهای متافازی در حضور COT-l DNA گاوی به مدت یک شب تحت تیمار FISH قرار گرفتند. مراحل ردیابی سیگنال های FITC و تهیه متافازهای RBPI- باندینگ به ترتیب با بهره گرفتن از سیستم آنتی بادی های FITC-avidin و anti-avidin و رنگ آمیزی اسلایدها با پروپیدیوم آیوداید انجام شد. تجزیه و تحلیل FISH موقعیت دقیق فیزیكی و باندهای كروموزومی مربوط به ژن های مورد مطالعه را روی متافازهای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز نشان داد. جایگاه دقیق فیزیكی ژن BMPR1B در گاو، گوسفند و بز یكسان بود (BTA/OAR/CHI6q15). در گاومیش رودخانه ای، ژن BMPR1B روی موقعیت BBU7q21 مكان یابی شد. ژن BMP15 در گاو و گاومیش رودخانه به ترتیب روی BTAXq31 و BBUXq36 و در موقعیت همولوگ (OAR/CHIXq24) در گوسفند و بز مكان یابی شد. برای جایگاه GDF9، موقعیت های كروموزومی BTA7q22.3، BBU9q24، OAR5q22.3  و CHI7q22.3 به ترتیب برای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز شناسایی شدند. داده های حاصل شده از مطالعه حاضر علاوه بر توسعه نقشه های سیتوژنتیک گونه های مطالعه شده باعث توسعه اتصال نقشه های ژنتیكی روی باندهای اختصاصی كروموزومی شده و همچنین می تواند برای مطالعات ساختاری و عملكردی دقیق تر ژن های اخیر مخصوصاً در گاوسانان مورد استفاده قرار گیرد. انتظار می رود كه علاوه بر ردیابی دقیق موقعیت مکانی ژن ها روی کروموزوم ها، بتوان هر چه بیشتر از تکنیک های مبتنی بر سیتوژنتیک مولکولی در مطالعات مرتبط به شناسایی نواقص کروموزومی و امکان ارتباط آن ها با صفات اقتصادی، خصوصاً صفات تولید مثلی در دام های اهلی استفاده نمود. قابل ذکر است که شناسایی موقعیت مکانی ژن ها روی کروموزوم ها، منجر به این خواهد شد که ردیابی QTLها در حوالی این ژن ها هر چه سریع تر و با هزینه کمتر گیرد.

فصل اول: مقدمه و کلیات

1-1- مقدمه

هدف اصلی در پژوهش های ژنومی حیوانات اهلی تهیه نقشه های ژنومی جامعی است که بتواند شناسایی جایگاه های موثر بر صفات مهم اقتصادی را امکان پذیر سازد. انتظار می رود که شناسایی چنین جایگاه­هایی منجر به طراحی برنامه های کارآمد اصلاح نژادی، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتیجه افزایش صحت و پیشرفت انتخاب در حیوانات مزرعه­ای شود. اگر چه نقشه های ژنتیکی که تا کنون برای حیوانات اهلی تهیه شده ­اند برای ردیابی ژن ها و جایگاه های صفات کمی در فواصل 10-5 سانتی مورگان (cM) و شروع برنامه های MAS کفایت می کنند، اما شناسایی دقیق جایگاه فیزیکی ژن ها و سپس كلونینگ و ردیابی واریانس های ژنتیکی آن ها و در گام بعدی مطالعه ارتباط این واریانس ها با صفات اقتصادی در اکثر موارد به ویژه در نژادهای موجود در کشورهای در حال توسعه از جمله ایران، به پژوهش های بیشتری نیاز دارند. به کارگیری داده های ژنوتیپی در ارزیابی های ژنتیکی تجاری و استراتژی های انتخاب بهینه، از جمله چالش های اصلاح نژادی می باشند که قطعاً نیازمند پیشرفت های بیشتری هستند.

خرید فایل متن کامل در سایت zusa.ir

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *